芯片表面DNA分子机器的构建与单碱基突变的检测

【摘要】单核苷酸多态性(SNPs),是指基因组DNA上某一个特定核苷酸位置上的单个碱基引起的变异,包括插入、删除和碱基错配。SNPs与人类遗传病密切相关,对早期诊断,药物响应测试,疾病预防,和特定遗传疾病的治疗至关重要,因此SNPs研究已成为遗传病学和预防医学研究的重点和热点。因此,发明一种简单,省时和高灵敏度的基因多样性检测的方法是非常有有价值和必要的。在此,我们提出了一种新颖的基于toehold协助下的表面增强链替换反应来实现单碱基突变检测的方法,整合界面检测和溶液检测的优势,首次将双链DNA”toehold交换探针”接枝到芯片表面,利用双偏振干涉技术(DPI),借助toehold协助下的DNA链替换反应原理实现了在芯片表面实时定量的研究单碱基突变的进程,实现单碱基突变在芯片表面的检测的过程。不仅实现了DNA全序列不同位点以及不同突变类型(插入、删除、错配)的突变检测,而且克服了溶液中正确的DNA目标链替换效率低的缺点,大幅度提高了正确的DNA目标链的替换效率(达到86.1%)同时又能很好的抑制有突变的DNA目标链的替换效率(约14%),大大提高了单碱基检测信号,可实现目标链浓度从0.8nM到1州的单碱基突变检测,检测限为0.8nM。同时,我们设计了一种简单实用的DNA微阵列芯片,借助普通荧光显微镜,在玻璃芯片表面实现了高通量的单碱基突变检测。同时,DNA是一种多才多艺的极其优秀功能材料,可以构建具有特殊功能的纳米结构和纳米器件。我们采用基于微流控的DNA微阵列技术,设计了新型的正交型微流DNA微阵列芯片来实现DNA分子机器在芯片表面上的运行。基于DNA链替换反应原理以催化链catalyst和荧光报告链FAM-reporter两种单链DNA为燃料,构建两种DNA分子机器,分别为DNA信号放大传感器分子机器和DNA逻辑门分子机器。通过两步的toehold协助下的DNA链替换反应,一方面构建了荧光信号放大的DNA信号放大传感器；另一方面,利用正交型微流DNA微阵列成功的在芯片表面构建了一个新型的“AND”逻辑门。最后,微流控技术是一种精确控制和操纵微升级(或纳升级)液体在亚微米结构的微通道中流动技术。我们设计了新型流动聚焦型微流控芯片。流体在微流通道中形成剪切流场(低雷诺数)。不同于宏观体系,在剪切力和表面张力的竞争作用下,产生的液滴在微尺度下的微流通道中形成特殊的排列现象-周期性类似‘晶格’排列现象。重点关注在微流体系中液滴周期性图案化排列和转变机理性的分析和研究。我们研究了液滴排列模式的两方面影响因素：水油两相的流速比值(流体流速影响)和微通道尺寸(几何结构影响)。当微通道宽度为250μm或300μm时,液滴形成单层分散,双层和单层挤压排列。最重要的是,当微通道宽度为350μm时,液滴会形成单层分散到三层排列到双层挤压最后到单层挤压排列。当出口通道宽度增加到400μm时,甚至出现了液滴四层排列的现象。于此同时,还仔细研究了各个液滴排列模式的“转变点”和“过渡区”。我们的结果为乳化实验提供了一个详细的策略来精确控制液滴大小和液滴模式,为合成分散或多分散的胶体粒子提供了理论指导。同时,该体系也有希望可以被应用到高通量微流控检测芯片的重要组成部分。
【作者】徐华国；
【导师】梁好均；
【作者基本信息】中国科学技术大学，高分子化学与物理，2014，博士
【关键词】单碱基突变检测；toehold协助下链替换反应；双偏振干涉测量技术；DNA分子机器；AND逻辑门；DNA信号放大传感器；微流控；微阵列；微流控DNA微阵列技术；液滴排列和转变；

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